实验材料 Qiagen®DNA迷你试剂盒

试剂、试剂盒 无水乙醇磷酸缓冲液

仪器、耗材 小离心管离心机水浴或可以维持56℃的烤箱涡流混合器

实验步骤

一、开始实验前，必须准备以下试剂：

(a)蛋白酶溶剂溶解：向 Qiagen® 冷冻干燥的蛋白酶中加适量蛋白酶溶剂。该溶液 2~8°C 保存 2 个月内稳定。

(b)AW 1 和 AW 2 缓冲液：向装有 AW 1 和 AW 2 浓缩液的瓶子中加人适量无水乙醇。AW 1 和 AW 2 缓冲液室温下一年内稳定。

(c)AL 缓冲液：用前颠倒充分混匀。

二、操作步骤

（试剂盒生产商的操作步骤，稍加修改）

如果细胞不是以培养基悬浮的细胞悬液，从步骤 5 进行。

如果收到的是在培养基中的细胞团：

1. 样品 20000 g 离心（离心机，如Eppendorf 5415D 或相似规格） 3 min 。

2. 用细尖移液管，小心移弃上清液。

3 . 以 200 μl PBSA 悬浮细胞。

4. 重复步骤 1、2 一次。

5. 以 200 μl PBSA 悬浮细胞。

6. 将 20 μl Qiagen® 蛋白酶加到标记好的 1.5 ml 空离心管（如 Eppendorf Biopure Safelock tubes）中。

7. 取 200 μl 各样品，加到相应标记的已加蛋白酶的离心管中。

8. 每管中加 200 μl AL 缓冲液（裂解缓冲液）。

9. 样品在 56°C 孵育 30 min 。

10. 每管用涡流混旋器混匀约 15 s。

11. 之后，1000 g 离心 3 s，使管中内容物聚到管底。 .

12. 小心打开每管，加人 200 μl 无水乙醇。

13. 每管用涡流混旋器混匀约 15 s。1000 g 离心 3 s，使管中内容物沉淀。

14. 小心将每管的内容物转移到对应标记的 QIAamp® 旋转柱中，该离心柱已置于收集管中。

15. 抒紧离心柱的盖子，6000 g 转 1 min 。

16. 将旋转柱置于干净的收集管中，弃掉含滤液的管子。

17. 小心打开旋转柱的盖子，加入 500 μl AW1 缓冲液。

18. 重复步骤 15 和 16。

19. 小心打开旋转柱的盖子，加入 500 μl AW2 缓冲液。

20. 拧紧盖子，20000 g 离心 3 min。

21. AW 2 对下游使用有破坏作用，所以建议更换收集管，旋转柱在以 20000 g 转离心 1 min 。确保所有的 AW 2 缓冲液已弃掉。

22. 将柱子放入对应标记的 1.5 ml 离心管中。

23. 打开柱子的盖，加 200 μl AE 缓冲液（洗脱缓冲液）。

24. 56°C 孵育 1 min，然后 6000 g 再离心 1 min 。

25. 每个样品的 DNA 进行定量，如用 Picogreen （Molecular Probes）。

26. 如果不是马上进行扩增，样品应冻存。